Akt1 및 akt2 isoforms 특정 다운 스트림 단백질의 규제를 통해 유방암 진행하는 동안 뚜렷한 역할을 | 과학 보고서

Akt1 및 akt2 isoforms 특정 다운 스트림 단백질의 규제를 통해 유방암 진행하는 동안 뚜렷한 역할을 | 과학 보고서

Anonim

과목

  • 분자 생물학
  • 종양학

추상

이 연구의 목적은 유방암 진행에서 AKT1 및 AKT2 이소 형의 특정 효과와 관련된 메커니즘을 설명하는 것이 었습니다. 우리는 IBH-6 및 T47D 인간 유방암 세포주에서 특정 AKT 이소 형의 풍부함을 조절하고, AKT1이 S6 및 사이클린 D1 상향 조절을 통해 세포 증식을 촉진 하였지만, β1- 인테그린 및 초점 접착 키나제를 통한 세포 이동 및 침습을 억제 함을 보여 주었다 ( FAK) 하향 조절. 대조적으로, AKT2는 F- 액틴 및 비 멘틴 유도를 통한 세포 이동 및 침입을 촉진시켰다. 따라서, AKT1의 과발현은 국소 종양 성장을 촉진시키는 반면, AKT1의 하향 조절 또는 AKT2의 과발현은 주변 주위 침습 및 폐 전이를 촉진 하였다. 또한, 우리는 침윤성 유방 암에 대 한 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 데이터 집합을 평가 하 고 AKT2하지만 증가 AKT1 mRNA 수준 임상 결과 나쁜 상관 관계가 발견. 우리는 AKT isoforms 지역 종양 성장에 관련 된 AKT1 및 먼 종양 전파에 관련 된 AKT2와 함께 유방암 진행의 다른 단계에서 특정 역할을한다 결론적으로 AKT2 더 나쁜 예 후 가치 및 결과적으로 치료에 대 한 가치있는 대상.

소개

유방암은 여성에게 가장 흔한 암이며 전 세계적으로 두 번째 사망 원인입니다 1 . 진단의 개선 및 종양 요법의 진보에도 불구하고, 암 사망은 종양 전파로 인한 것이다 2 . 정상 세포-세포 또는 세포-세포 외 기질 상호 작용에서의 섭동은 전이성 진행의 이전 단계 인 지하실 막 완전성 및 주변 조직 침윤의 붕괴를 초래한다 3 .

PI3K / AKT / mTOR는 유방암 4, 5를 포함한 대부분의 고형 종양에서 가장 일반적으로 규제가 완화 된 경로입니다. 경로의과 활성화는 성장 인자 독립적 인 세포 증식 6, 세포 침습 7, 내분비 수용체 탈 조절 8, 9 및 요법 10에 대한 내성을 통해 유선에서 종양 형성 및 종양 진행에 기여하는 것으로 입증되었다. PIK3CA, AKT 및 PTEN은 증가 된 돌연변이율을 나타내어 경로 조절 완화를 초래한다는 것이 입증되었습니다 11 . 그러나, PI3K 및 AKT가 각각의 종양 발달 단계 및 암 진행을 조절하는 메카니즘 및 하류 신호는 완전히 이해되지 않았다.

실험 모델에서, PI3KCA 돌연변이는 다운 스트림 키나제 AKT를 활성화시키고 발암 성 형질 전환을 유도하는 것으로 나타 났으며, 따라서 이러한 병변은 종양을 PI3K / AKT / mTOR- 지시 된 치료 억제에 매우 민감하게 만든다. 암의 경로를 목표로하는 엄청난 양의 임상 시험에도 불구하고, 유일한 승인 된 약물은 내분비 계에서 진행된 진행된 호르몬 수용체 양성 (HR +) / HER2- 음성 (HER2-) 유방암에 대한 Exemestane과 함께 mTOR 억제제 인 Everolimus입니다. 요법 14, 15 . 그러나, 경로 활성화 또는 PIK3CA 돌연변이와 유방암에서의 임상 결과 사이의 관계는 여전히 논쟁의 여지가있는 16, 17, 18, 19 입니다.

세 가지 AKT 이소 형이 있습니다. AKT1, AKT2 및 AKT3은 높은 서열 및 구조적 상 동성을 공유하지만 다양한 종양 유형 6, 20, 21, 22 에서 특이적이고 비 이중화 기능을 나타낸다 . 유방에서 AKT3의 역할은 지금까지 덜 연구되었지만 삼중 음성 종양에서 더 우세한 역할을하는 것으로 보입니다 23 . AKT1 및 AKT2 연구와 관련하여, 유방 암종을 갖는 몇몇 형질 전환 마우스 모델이 개발되었으며, 다양한 결과를 보여 주었다. ErbB2- 유도 모델에서, Hutchinson et al . 도 24 는 AKT1의 활성화가 종양 형성을 가속화하지만 종양 침습을 억제하는 반면 Ju et al . 25 는 AKT1의 증식 및 이주 역할을보고했다. MMTV-ErbB2 / neu 및 MMTV-PyMTV 모델에서 Maroulakou et al . 26 AKT1 절제는 종양 형성을 지연 시키지만 전이에는 영향을 미치지 않는 반면, AKT2 절제는 유선 종양 성장을 향상 시킨다고보고 하였다. 반대로 MTB-IGF-IR 모델에서 Watson et al . 27 은 AKT1 또는 AKT2 절제가 유방 종양 발병을 지연시키고 종양 성장을 억제한다고보고 하였다.

마우스와 인간의 유방암 세포에서 우리 그룹은 AKT1 의과 활성화가 도관-유사 종양 성장 9 및 내분비 수용체 8, 28 의 호르몬-비 의존적 활성화로 이어진다 고 설명했다 . 다른 연구는 AKT1이 ERK 규정 29 또는 NFAT 30 의 분해에 의해 세포 이동을 억제하는 반면, AKT2는 β1- 인테그린 31 및 팔라딘 상향 조절 32를 통한 세포 침습을 촉진한다는 것을 보여 주었다. 이들 및 다른 연구 33, 34 는 AKT1의 억제가 종양 세포 침습성 및 전이성 질환을 유발할 수 있다고 가정 하였다. 그러나, 상기 언급 된 인간 유방암 모델 중 어느 것도 공격적인 표현형 및 생체 내 질병 진행 에서 AKT1 및 AKT2에 대한 특정 역할을 완전히 구별하지 않았다. 본 연구는 배양 및 이종 이식에서 성장하는 2 개의 인간 도관 유방암 세포주에서 유방암 진행의 상이한 단계를 조절함에있어서 AKT1 및 AKT2의 특이 적 역할 및 신호 전달을 분석하도록 설계되었다.

결과

AKT2가 아닌 AKT1은 세포 증식을 촉진한다

AKT1 의과 활성화는 유선 종양 성장 9, 20, 25, 28으로 이어진다는 것이 밝혀 졌다 . 이 연구에서, 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체 양성 (ER + / PR +) IBH-6 및 T47D 암 세포는 안정적으로 변형되어 구체적으로 AKT1 또는 AKT2 이소 형을 상향 조절 또는 하향 조절하고 세포 증식, 접착 및 침윤에 대한 그들의 특정 효과를 검색 하였다.

AKT1 (myrAKT1) 또는 AKT2 (myrAKT2)의과 활성화는 세포막에서 구성 적으로 활성 단백질을 유지하는 미리 스토 릴화 서열로 생성되었다. shRNA 구성으로 AKT1 (shAKT1) 또는 AKT2 (shAKT2)의 하향 조절이 생성되었다. 특정 이소 형의 각각의 조절은 단백질 발현 (도 1a 및 b 및 보충도 S1a, b 및 c) 및 인산화 (도 1c 및 d 및 보충도 1d)의 평가에 의해 확증되었다. pSer473AKT (그림 1c 및 d)와 pThr308AKT (보조 그림 1d)의 인산화에서 이소 형 특이 적 조절을 구별 할 수 없었습니다. 이들 항체는 AKT 이소 형을 구별하지 않기 때문에 차별적 활성화를 나타내는 것입니다.

Image

( ab ) myrAKT 및 shAKT 세포에서 각각 AKT1 또는 AKT2 상향 조절 (왼쪽) 및 하향 조절 (오른쪽)을 나타내는 WB. 녹색으로 표시된 ( c, 왼쪽 ) WB 및 ( d ) IF는 AKT1 및 AKT2 결핍 IBH-6 세포에서 감소 된 pSer473AKT 수준을 나타낸다. ( c, 우측) WB는 AKT1 및 AKT2 결핍 T47D 세포에서 감소 된 pSer473AKT 수준을 나타내는 것이다. pSer473AKT에 대한 항체는 Ser473에서 모든 인산화 된 AKT 이소 형을 인식한다. ( ef ) AKT- 과발현 (왼쪽) 또는-결핍 (오른쪽) 세포에서의 세포 증식. ( g ) IBH-6 AKT 결핍 세포에서 사이클린 D1에 대한 WB (왼쪽) 및 정량 (오른쪽). (H) IBH-6 AKT- 결핍 세포에서 pSer240S6 (pS6, 상부 패널) 및 총 S6 (하부 패널)에 대해 녹색 인 경우 IF. 핵은 PI로 붉은 색으로 염색되었다. 로딩 컨트롤로 ERK1 / 2 또는 α-Tubulin을 사용했습니다. * p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001 대 대조군 또는 shco 세포. n = 3 (ANOVA, Dunnet의 사후 테스트). a, b, cg의 블롯이 잘 렸습니다. 전장 블롯은 보충 그림 S6에 제시되어 있습니다.

전체 크기 이미지

그런 다음 AKT 변조가 세포 증식에 ​​미치는 영향을 분석했습니다. 예상 한 바와 같이, 두 세포주 모두에서, AKT1 과발현이 증가한 반면, 그의 하향 조절은 세포 증식을 감소시켰다. 그러나, 세포 성장에 대한 AKT2의 효과는 덜 명확 하였다 (도 1e 및 f). 세포 증식에 ​​대한 통계적으로 유의미한 하향 조절은 IBH-6 shAKT2 세포에서만 관찰되었다 (도 1e, 오른쪽). 또한, IBH-6 shAKT1 세포에서 세포 증식의 억제는 시클 린 D1 하향 조절 (도 1g) 및 S6 발현 및 인산화의 감소를 동반 하였다 (도 1h). 그러나, AKT2는 사이클린 D1 또는 S6 조절에 영향을 미치지 않았다. T47D 세포에서도 유사한 결과가 관찰되었다 (보조도 1e 및 f). 이들 결과는 IBH-6 및 T47D 세포에서, AKT2가 아닌 AKT1이 S6 및 사이클린 D1 조절을 통해 세포 증식을 제어한다는 것을 나타낸다.

AKT1과 AKT2는 세포 이동 및 침입에서 다른 역할을 수행합니다.

우리는 세포 공격성에 특정 AKT downregulation의 효과 분석. IBH-6 상피 세포는 방추형 형태를 나타낸다 ( 35) . 단일 층 배양 (2 차원, 2D)에서, IBH-6 shAKT1 및 IBH-6 shAKT2 세포는 IBH-6 shco 세포와 비교하여 크기 및 형태를 보존 하였다 (보조도 S2a). T47D shAKT1 및 T47D shAKT2는 또한 크기와 형태를 2D로 유지했습니다 (표시되지 않음).

3 차원 (3D) 지하실 막 Matrigel에서, IBH-6 shco 세포는 위에 모이고 일부 세포는 Matrigel을 침범합니다 (보조도 S2b). AKT1의 하향 조절은 침습성 표현형을 증가시키는 반면, AKT2의 하향 조절은이 표현형을 억제하고 세포는 응집체로 남아 있었다 (보충도 S2b). 일관되게, 상처 치유 분석에서 shAKT1 세포는 IBH-6 shco 세포와 유사한 이동 용량을 가졌지 만, shAKT2 세포는이를 감소시켰다 (도 2a). 또한, shAKT1이 증가하고 shAKT2가 Matrigel을 침범하는 능력을 감소시켰다 (도 2b). 침습성 표현형에 대한 AKT1 및 AKT2의 차등 효과는 T47D 세포에서 덜 명백 하였다 (미도시).

Image

( a ) 상처 치유 분석. 한 실험의 T0 및 Tf (21 시간 후)의 대표 사진 (왼쪽). 막대 그래프는 마이그레이션 영역의 수량을 나타냅니다 (오른쪽). ( b ) 트랜스 웰 침입 분석 (왼쪽). 막대 그래프는 Matrigel에 침입하여 26 시간 후에 삽입물의 반대쪽에 부착 된 세포의 평균을 나타냅니다 (오른쪽). ( ce ) β1- 인테그린 및 pTyr861FAK (pFAK)에 대한 IF. ( df ) β1- 인테그린 및 pFAK의 대표적인 WB (좌) 및 정량 (우). ( g ) 적색 F- 액틴 섬유에서 팔로이 드린이 염색되는 경우 (왼쪽) 및 F- 액틴 강도의 정량화 (오른쪽). ( h ) 비 멘틴 (왼쪽) 및 비 멘틴 염색의 정량 (오른쪽)에 대한 IF. 핵은 PI를 사용하여 적색으로 대조 염색되었다 ( g 제외). 흰색 화살표는 구두점 위치 ( ce ) 및 액틴 섬유 ( g )를 나타냅니다. * p <0, 05; ** p <0, 01. n = 3. df 의 얼룩이 잘 렸습니다. 전장 블롯은 보충 그림 S7에 제시되어 있습니다.

전체 크기 이미지

그런 다음 이중 이소 형 침묵 (shAKT1 / 2)의 효과를 분석했습니다. 이를 위해, IBH-6 세포를 공동 감염시켜 AKT1 및 AKT2를 동시에 하향 조절 하였다 (보조도 S3a). ShAKT1 / 2 세포는 shAKT1 세포와 유사하게 증식을 감소시켰다 (보충도 S3b). 또한, shAKT1의 효과는 shAKT2의 효과보다 우세하였으며, 그 결과 표현형은 IBH-6 shAKT1 / 2 세포의 이동 (보조도 S3c) 및 침습적 (보조도 S3d) 용량의 증가였다. 이러한 결과는 AKT1이 세포 이동 및 침입 자체를 억제하고 그 효과가 AKT2보다 우세하다는 것을 입증한다.

세포 접착 및 침입 단백질의 AKT1 및 AKT2 반대 조절

인테그린은 단백질 키나아제 이펙터를 통한 세포-세포 외 매트릭스 상호 작용에 관여하고 세포 내 및 세포 외 단백질의 활성 및 국소화를 조절하여 세포 파종을 촉진하는 세포막 수용체 패밀리에 속한다 36, 37 .

이전 연구에서, 본 발명자들은 AKT1 하향 조절 된 초점 접착 키나제 (FAK) 발현의과 활성화가 IBH-6 세포 접착의 감소를 초래 함을 입증 하였다 9 . 이 연구에서 우리는 AKT1 또는 AKT2의 downregulation 후 β1-integrin 및 FAK 수준을 분석했다. shAKT1 세포에서 β1- 인테그린이 증가 하였다 (도 2c 및 d). 일관되게, FAK의 인산화 (pFAK)는 shAKT1 세포에서 증가하였고 shAKT2 세포에서 변화하지 않았다 (도 2e 및 f). shAKT1 세포에서도 MMP9가 증가 하였다 (미도시). 또한, shAKT1 세포에서, β1- 인테그린 및 pFAK는 특히 막힌 국소화에서 막 가장자리 근처에서 증가되었다 (도 2c 및 e).

우리는 또한 일반적으로 세포 이동 중에 규제가 해제 된 cytoskeleton 구성 요소 F-actin 및 vimentin을 분석했습니다. IBH-6 shAKT1 세포가 명확하게 정의 된 액틴 섬유를 갖는 shco 세포와 유사한 수준의 F- 액틴을 발현하는 반면, IBH-6 shAKT2 세포는 비정의 필라멘트를 갖는 약한 발현 패턴을 나타냈다 (도 2g). 또한, IBH-6 shco 세포는 높은 수준의 비 멘틴을 발현하지만, shAKT1은이 단백질의 수준을 편광 패턴으로 감소시켰다 (도 2h). ShAKT2 세포는 비 편광 패턴으로도 비 멘틴의 수준을 감소 시켰지만 Matrigel을 침범하는 능력의 감소와 일치 하였다 (도 2h). 그러나, AKT1 및 AKT2의 과발현은 2D에서 세포 형태를 변화시키지 않았지만 (보충 그림 S4a), myrAKT1 세포는 pFAK의 수준 및 분극을 감소 시켰고 (보충 그림 S4b), 반면 myrAKT2 세포는 F- 액틴 중합을 증가시켰다 (보충 그림 S4c). 야생형 (WT) 세포는 ACL-4.1 또는 pCDNA3 대조군 형질 감염된 세포 (도시되지 않음)와 유사한 거동을 나타냈다. 전체적으로, 이들 결과는 세포 침윤이 하류 이펙터를 통해 AKT1 및 AKT2에 의해 다르게 조절됨을 시사한다. 즉, 세포 부착 단백질 β1- 인테그린 및 FAK는 AKT1에 의해 우선적으로 억제되는 반면, 세포 골격 성분 F- 액틴 및 비 멘틴은 AKT2에 의해 우선적으로 유도된다.

AKT1 및 AKT2는 이종 이식편에서 상이한 유방암 표현형을 생성한다

이전 연구에서, 우리는 면역 억제 된 동물에 주사 된 IBH-6 myrAKT1 세포가 IBH6 ACL-4.1 세포보다 빠르게 성장하는 종양을 생성하는 것으로 나타났습니다 9 . 여기, 우리는 IBH-6 shAKT1 세포가 IBH-6 shco 세포에 비해 낮은 성장률로 더 작은 종양을 발생 시켰음을 보여줍니다 (그림 3a). 반대로, IBH-6 shAKT2 세포는 종양 레이턴시 또는 성장률을 변화시키지 않았다. IBH-6 shco 세포가 IBH-6 WT 세포 38 과 유사하게 성장하는 종양을 생성하였고, 모든 IBH-6- 유래 세포주는 외인성 호르몬 공급이없는 상태에서 성장한다는 것을 언급 할 가치가있다. IBH-6 shco 및 shAKT2 종양이 너무 빨리 자라기 때문에 NIH 지침 및 39 에 따라 최대 허용 크기에 도달하면 동물을 희생시키고 조직, 전이의 존재를 분석하기 위해 종양, 폐 및 간을 제거했습니다.

Image

( a ) NSG 마우스에서 IBH-6 shco 및 AKT- 결핍 세포의 성장 곡선. ( b ) 종양 샘플에서 HE, 화살표는 인접한 지방 조직의 종양 침습을 나타낸다. IBH-6 shco 종양은 IBH-6 WT 암종과 유사하게 잘 분화되지 않았으며, 2 개의 세포 집단이 명확하게 정의되었다 : 하나의 상피 형 및 다른 스핀들 형 (삽입). ( c ) Ki67 및 ( d ) β1- 인테그린 염색. ( e ) IBH-6 shAKT1 종양-보유 동물의 폐에서 HE, 12 마리 동물 중 6 마리에서 다형 핵 세포 침윤 (왼쪽, 화살표로 표시) 및 2 개의 전이 병소 (오른쪽)를 나타내는. *** p <0, 001. 종양 성장 곡선에 대한 각 실험 그룹에서 n = 4. 실험은 이중으로 수행되었다.

전체 크기 이미지

종양 조직학은 하향 조절 된 특정 AKT 이소 형에 따라 관련 차이를 보여 주었다 (도 3b). IBH-6 shAKT1 종양은 상피 세포가 거의없는 스핀들 섬유 모세포-유사 집단이 풍부 하였다 (도 3b, 삽입). 또한, 감소 된 성장률에도 불구하고, shAKT1 종양은 인접한 지방 조직의 침습의 명백한 징후를 나타냈다 (도 3b, 화살표). 반대로, IBH-6 shAKT2 종양은 침범의 징후가없는 덜 스핀들 형 형태를 나타냈다 (도 3b). 본 발명자들은 shco 및 AKT- 결핍 종양에서 AKT1 및 AKT2의 발현을 IHC에 의해 분석하여 (보조 그림 S5a 및 b) 특정 AKT dowregulation을 확인 하였다. ShAKT1 종양은 감소 된 증식 속도 (도 3a)로 구성된 더 적은 Ki67- 양성 세포 (도 3c)를 나타냈다. 마지막으로, 종양에서 β1- 인테그린 수준은 세포 배양에서 얻은 결과를 재현했다; 즉, shco 종양과 비교하여 shAKT1 수준이 증가하고 shAKT2 종양 수준이 감소했습니다 (그림 3d).

실험 종료 후, 세포 접종 40 일 후, 어느 실험군에서도 전이 병소가 발견되지 않았다 (도시되지 않음). 그럼에도 불구하고, shAKT1 종양-보유 동물로부터의 폐는 다형 핵 세포 침윤 (도 3e, 좌측)과 같은 염증의 징후를 보여, 순환 세포에 대해 유리한 전이 전성 틈새를 시사한다. IBH-6 shAKT1 세포에 대한 장기 실험 (세포 접종 후 60 일)은 폐 전이를 발생시켰다 (도 3e, 오른쪽). 동물 복지 문제로 인해 shco 또는 shAKT2 종양을 가진 동물에서는 장기 실험이 불가능했습니다.

유사하게, T47D 이종 이식편에서 AKT1 침묵은 종양 성장을 감소시키는 반면, AKT2 침묵은 대조군 종양과 비교하여 성장 속도를 변화시키지 않았다 (도 4a). T47D shAKT1 종양의 크기는 더 작았지만, 침윤의 징후가 분명하고 인접한 지방 조직을 침범하는 세포 그룹이있는 유일한 종양이었다 (도 4b, 화살표). AKT 이소 형-특이 적 하향 조절은 IHC에 의해 확인되었다 (보완도 S5c 및 d). T47D shAKT1 종양은 낮은 수준의 E- 카드 헤린 및 높은 수준의 비 멘틴을 발현하는데, 이는 줄기 표현형의 전주 일 수있는 반면, shAKT2 종양은 반대 패턴, 높은 E- 카드 헤린 및 낮은 비 멘틴을 나타냈다 (도 4c). 침묵 된 이소 형을 갖는 임의의 동물에서 희생 시점에 전이 병소가 관찰되지 않았다 (도시되지 않음).

Image

NSG 마우스에서 ( a ) T47D shco 및 AKT- 결핍 세포 또는 ( d ) T47D WT 및 AKT- 과발현 세포의 성장 곡선. ( be ) 종양 샘플에서 HE, 화살표는 인접한 지방 또는 근육 조직의 종양 침습을 나타낸다. ( c ) T47D shco 및 AKT- 결핍 종양에서 E- 카드 헤린 및 비 멘틴 염색. ( f ) 12 마리 동물 중 8 마리에서 전이 병소를 나타내는 T47D myrAKT2 종양-함유 동물의 폐에서의 HE. ( g ) 폐의 판-시토 케라틴 얼룩 상피 전이성 세포에 대한 IHQ. ** p <0, 01; *** p <0, 001. 종양 성장 곡선에 대한 각 실험 그룹에서 n = 3. 실험은 이중으로 수행되었다.

전체 크기 이미지

AKT 이소 형의 차등 침습 기능의 결과를 확인하기 위해, 특정 이소 형을 과발현시켰다. T47D myrAKT1 이종 이식편은 IBH-6 myrAKT1 이종 이식편 9 에서 이전에 관찰 된 바와 같이 더 낮은 종양 레이턴시 및 증가 된 성장을 나타냈다 (도 4d). 그러나, 15 일 후, T47D myrAKT1 종양의 성장 속도는 T47D WT 종양의 성장 속도와 유사 하였다 (도 4d). T47D myrAKT1 세포의 성장 속도의 이러한 둔화는 이들 세포가 여전히 성장을위한 에스트라 디올 공급에 의존하기 때문일 수있다. T47D myrAKT2 이종 이식편은 WT 이종 이식편과 유사한 성장률을 나타 냈지만 (도 4d), 실제로는 인접한 근육 조직의 침범으로 소엽 종양과 유사한 조직학을 나타냈다 (도 4e, 화살표). 또한, 장기 실험 (세포 접종 후 60 일)은 상피 마커 시토 케라틴 (도 4g)에 대해 양성인 T47D myrAKT2 종양 보유 동물의 폐에서 전이 병소를 보여 주었다 (도 4f). T47D WT는 전이성 세포주가 아니라는 것을 언급 할 가치가있다.

AKT1 및 AKT2 종양 수준은 침습성 유방암의 생존율과 차등 적으로 관련이 있습니다.

마지막으로, AKT1 및 AKT2 종양 수준이 환자의 유방암 진행과 관련이 있는지 여부를 평가하기 위해, DNA 증폭, 돌연변이가있는 데이터 세트로 구성된 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 웹 사이트 40, 41 에서 입수 가능한 침윤성 유방 암종 1105 개 샘플을 평가했습니다., 결실 및 mRNA 상향 및 하향 조절 (도 5a). AKT1 및 AKT2에 대한 mRNA 발현 데이터 프로파일만을 고려하면, AKT1이 아닌 AKT2가 전체 생존율이 낮다는 것을 알 수 있었다 (도 5b).

Image

( a ) TCGA로부터의 1105 유방 침습성 암종 샘플에서 AKT1 (변경 율 11 %) 또는 AKT2 (변경 율 10 %) 유전자 변경. AKT1 및 AKT2의 경우, 환자 샘플에서 주요 변경은 mRNA의 상향 조절이었다. ( b ) AKT2의 mRNA 상향 조절이 AKT1의 mRNA 상향 조절보다 더 나쁜 전체 생존율 (p = 0.0535)과 관련이 있음을 보여주는 참조 집단에서의 카플란-마이어 곡선 (p = 0.935).

전체 크기 이미지

실험 모델과 TCGA 메타 분석에서 우리의 발견은 유방암의 종양 진행이 AKT1과 AKT2 이소 형을 차별적으로 포함한다는 생각을 뒷받침합니다. 결론적으로, AKT1 및 AKT2 수준은 진단 과정 초기에 유방암 진행의 바이오 마커로 사용되어 어느 부분의 환자가 더 빨리 진행하여 결과적으로 임상 결과가 더 나빠질 수 있는지를 구별 할 수 있습니다. 우리는 질병 진행과 관련이 있고 유방암에서 예후가 더 나쁜 AKT2 과발현이라는 실험적 및 임상 적 증거를 제공합니다.

토론

우리의 결과 AKT1 및 AKT2 isoforms 유방암 세포를 다르게 조절 보여줍니다. 여기 우리는 AKT1 및 AKT2 종양 성장 및 IBH-6 및 T47D 인간 세포주에서 보급에 특정 역할을하는 메커니즘을 설명합니다. 우리는 AKT1 S6 및 cyclin D1 upregulation 통해 세포 증식 및 생존에 관련 된 것을 발견했다. 비록 각각의 이소 형이 β1- 인테그린, FAK, E- 카드 헤린, F- 액틴 및 비 멘틴 발현을 차등 적으로 조절하고 (도 6a) 결과적으로 공격적인 표현형에 반대 효과를 갖지만, AKT1 및 AKT2는 세포 이동 및 침습에 관여한다 (도 6a). 6b). AKT1- 및 AKT2- 특이 적 세포 기능은 또한 생체 내 이식으로 인식 될 수 있고, 본 발명자들은 인접 지방 및 근육 조직뿐만 아니라 shAKT1 및 myrAKT2 이종 이식편으로부터 유래 된 폐 전이의 침습을 기술한다.

Image

( a ) AKT1 및 AKT2의 특이 적 신호 전달 및 특정 다운 스트림 단백질 조절. ( b ) 종양 성장 및 종양 침습에 대한 AKT1 및 AKT2 특이 적 기능에 대한 대표적인 계획.

전체 크기 이미지

암에서 AKT 이소 형의 역할에 관한 연구가 증가 함에도 불구하고, 이들의 특정 역할은 여전히 ​​명확하게 밝혀지지 않았으며, 결과는 세포 유형 및 상황에 의존적이다. 이것은 예후 가치를 더 잘 정의하기 위해 암 진행 중 각 AKT 이소 형의 특이성을 이해하는 것과의 관련성을 강조합니다. 현재까지의 대부분의 실험 연구는 막-표적화 된 돌연변이 체와 같은 AKT의과 활성 변이체, 또는 시험 관내 shRNA와 같은 녹다운 전략을 사용 하였다. 이 방법으로, 성장 유도제로서 AKT1 및 성장 및 침습 억제제로서 AKT2의 뚜렷한 역할은 종양 및 미세 환경 내에서 난소 암 세포에서 잘 정의되었다 ( 22) . 유방암에서, 트랜스 제닉 마우스 모델의 대부분의 데이터는 AKT1이 유방암 유도에 결정적인 반면, AKT2는 전이성 전파 20, 26 에 더 관여한다는 데 동의합니다.

유방암 및 난소 암 세포에서, AKT2- 유도 된 이동 및 침윤은 β1- 인테그린 31 의 상향 조절과 관련이 있지만, 전립선 암 세포에서, AKT1 및 AKT2 둘다는 β1- 인테그린의 하향 조절을 통한 세포 이동 및 침습을 감소시켰다. 여기 우리는 AKT1, 하지만 AKT2의 특정 downregulation 증가 β1-integrin 식 및 초점 접착 사이트 호환 구두점 막 영역에서 FAK 인 산화 IBH-6 세포에 보여줍니다. FAK는 성장 인자 및 인테그린-자극 된 세포 운동성의 조절에서 AKT의 상류 및 하류로 간주 될 수있다. 우리는 이전에 IBH-6 세포에서 AKT1의과 활성화가 감소한 반면, PTEN의 과발현은 FAK 수준 9를 증가 시켰음을 보여 주었다. 대조적으로, 인간 결장암 세포에서 Wang et al . 43 은 AKT2가 아닌 AKT1이 FAK에 직접 결합하여 인산화하는 것으로보고 하였다. 또한, 여기 우리는 암 세포 마이그레이션에 관련 된 말라 cytoskeleton의 리모델링에 AKT2, AKT1의 참여를 보여 주었다. 우리의 결과는 AKT2가 유방암 세포에서 주된 역할을한다는 것을 확인시켜줍니다.

여러 연구에서 E-cadherin을 종양 억제 유전자로 간주하여 감소 된 발현이 종양 진행의 요구 사항임을 시사합니다. 3D Matrigel에서 성장하고 생쥐 유선 관으로 주사 된 MCF10A 세포에서 AKT1의 과발현은 계내 유사 병변 44 와 같은 관 상피암과 유사하다. 유사하게, 본 발명자들은 AKT1이 3D 배양 및 생체 내 9 에서 덕트 분화에 관여하고 myrAKT1 유방암 세포가 높은 E- 카드 헤린 발현을 갖는 조직 및 극성 유사 구조를 형성한다는 것을 이전에보고 하였다. 여기 우리는 AKT 특정 불충분 한 T47D 종양 표시 전자 cadhein 및 vimentin 역 규제 보여줍니다. E- 카드 헤린의 손실에도 불구하고, AKT1- 효율적인 종양은 더 높은 수준의 비 멘틴으로 응집성 침습 세포를 유지한다. 우리는 그것이 종양의 침습적 등급을 결정하는 개별 세포의 단백질 수준보다는 침습성 단백질 사이의 균형 일 가능성이 높다고 가정한다. 전반적으로, 본 발명자들은 AKT1이 질환의 초기 단계 동안 침습 억제제로서 기능하는 것으로 추측하여, AKT2는 질환의 진행 단계에서 세포 침습 및 공격성을 향상시킨다 (도 6b).

마지막으로, 우리는 TCGA에서 유방 침윤성 암의 1105 개 샘플에 대한 단 변량 분석에서 AKT1 mRNA 수준의 양을 증가시키는 돌연변이를 가진 환자가 전체 생존 기간이 짧은 AKT2 수준의 돌연변이를 가진 환자보다 더 나은 결과를 가지고 있음을 발견했습니다. . 결과적으로, 우리의 연구는 AKT2가 유방암에서 불량한 임상 결과의 예후 마커를 구성한다고 제안한다. 이 결론은 여기에 두 개의 인간 유방암 세포주에서 설명한 세포 기전에 의해 뒷받침됩니다.

암 예후와 AKT 발현과 관련된 최근의 연구는 평가 된 인구의 특성과 기술적 접근 45, 46, 47에 따라 모순되는 결과를 보여 주었다. Pereira et al . 47 은 AKT2가 줄기 세포와 유사한 특성의 획득에 관여하며, 침습성 및 화학 저항성 및 최악의 유방암 결과를 책임 진다고 지적했다. 그러나 Fohlin et al . 도 46 은 AKT2 및 pAKT (pSer473AKT) 수준이 더 낮은 원격 재발률과 관련이 있음을 입증 하였다. 같은 줄에서 Grell et al . 45 는 AKT2 발현 및 pAKT의 동시 존재 (pThr308AKT 및 / 또는 pSer473AKT)가 트라 스투 주맙으로 치료 된 HER2 + 전이성 환자에서 더 나은 결과와 관련이 있음을 보여 주었다. 또한, Badve et al . 48 pAKT (pSer473AKT)의 핵 국소화는 ER + / PR + 유방암 환자에서 장기적으로 더 나은 생존과 관련이 있음을 발견했습니다. 다른 연구에 따르면 AKT1은 초기 유방암의 진행을 촉진시키는 반면 AKT2는이 효과를 49, 50, 51로 되돌립니다. 또한, Plant et al . 도 52 는 유방 종양 진행 동안 AKT1에서 핵에서 세포질로의 셔플을 기술 하였다. 이 사건은 우리가 여기에보고 한대로 종양 조직의 차등 단백질 활성화와 관련이있을 수 있습니다. 즉, 초기 단계의 증식 단백질 및 β1- 인테그린과 같은 ECM 리모델링 단백질의 단계. 이 모든 다른 증거들은 질병의 초기 및 말기 단계에서 AKT1 및 AKT2에 대한 강력한 평가가 새로운 예후 마커로 제안됨을 조언합니다. 전립선 암 환자에서, AKT 발현 및 인산화는 바람직하지 않은 결과와 유의하게 연관되었으며, 시토 졸 AKT1 발현은 수술 후 재발의 위험이 높고 pAKT 수준이 불량한 임상 결과를 예측했다.

마지막으로, AKT 이소 형-특이 적 신호 전달의 분자 메카니즘을 해부하려는 노력은 암 치료 23, 54, 55, 56, 57에 대해보다 효과적이고 선택적인 치료제를 설계하기위한 새로운 통찰력을 제공 할 것이다. 이와 관련하여, 이소 형-특이 적 siRNA, 마이크로 RNA, 억제제 및 항체는 각각의 AKT 이소 형 신호의 상대적 기여 및 암 퍼짐에 대한 국소화를 설명하는 도구를 구성한다. 유방암 세포주에서의 우리의 결과는 AKT1 / AKT2 이중 침묵이 세포 증식을 감소 시키지만, 놀랍게도 세포 이동 및 침윤을 향상 시킨다는 것을 보여준다. 전반적으로, 본 발명자들의 결과는 PI3K 또는 AKT1 / 2 수준에서의 표적화가 종양 진행을 예방하는데 효과적이지 않을 것이지만, 구체적으로 AKT2 구동 신호를 표적화하는 것이 암 공격성을 예방하는데보다 효과적 일 수 있음을 시사한다. 이제 과제는 유방암 진행을 감소시키는 데 최적의 효능을 달성하기 위해 PI3K 및 / 또는 mTOR을 표적으로하는 약물과 함께 AKT2 활성화 된 다운 스트림 신호 전달에 대한 새로운 표적 요법을 시도하는 것입니다. MK2206, AZD5363을 포함하는 PanAKT 억제제는 현재 췌장암, 결장 직장암, 유방암 및 전립선 암과 같은 진행성 고형 악성 종양에 대한 임상 시험 중이다. AKT 이소 형에 대한 선택적 억제제는 전임상으로 개발되고 시험되었지만 아직 임상 시험에 도달하지 못했다 (즉, AKT2 및 항 종양 활성에 대한 선택성이 더 큰 CCT128930). 세포 공격성에서 이들 또는 다른 AKT 억제제의 효과는 현재 데이터에 비추어 AKT 이소 형이 특정 역할을한다는 것을 시사하는 추가 실험적 연구를 필요로한다. 우리의 연구는 진행된 유방암의 치료를 위해 AAKT2의 특이 적 파괴가 panAKT 억제보다 바람직 할 수 있음을 시사한다.

결론

우리의 연구 결과 질병 진행 및 새로운 치료에 대 한 잠재적 인 대상의 바이오 마커로 AKT1 및 AKT2의 사용을 안내하는 근거를 제공합니다. 예후 지표로서의 사용은 이러한 발암 성 신호 전달이 임상 환경에서 표적화되는 경우 PI3K / AKT / mTOR 성분의 발현을 정확하게 평가하는 것의 중요성을 강조한다. 또한, 질병의 각 단계에 관련된 AKT1 및 AKT2 신호의 다운 스트림 성분의 식별은 진행을 지연 또는 차단하기위한 새로운 바이오 마커-구동 요법의 구현을 용이하게 할 것이다.

여기에 표시된 결과를 바탕으로, PI3K, panAKT 또는 특정 AKT1 억제는 권장되지 않을 수 있으며, 종양 침습 및 암 전파를 촉진 할 수 있기 때문에 유방암에 금기 사항이 될 수도 있습니다. 반대로, AKT2 또는 그의 하류 분자의 녹아웃은 적어도 전이성 질환에 대해 유방암 치료 결과를 개선시키는 더 나은 선택 일 수있다.

재료 및 방법

세포주 및 배양

IBH-6 세포주는 34 세의 폐경 전 여성 35 에서 유래하며, ER 및 PR을 발현하고 호르몬 공급이없는 NSG 동물에서 자랍니다 38 . T47D 인간 세포주는 NSG 마우스 28 에서 성장하기 위해 0, 25 mg의 17β-estradiol의 이전 주사가 필요합니다.

두 세포주 모두 DMEM F12 (MO, Sigma Aldrich 세인트루이스, MO) 10 % 태아 소 혈청 (FBS, Natocor Córdoba Argentina) 배지에서 유지시켰다. 3D 배양을 위해 세포를 Matrigel (BD Biosciences San Jose, CA)에 시딩 하였다.

체외 연구

형질 감염 및 감염

IBH-6 및 T47D 세포주는 안정적으로 형질 감염되어 AKT1 (pACL4.1-myrAKT1 9 ) 또는 AKT2 (pCDNA3-myrAKT2, Addgene # 9016)를 과발현한다. 제조사의 지시에 따라 리포 펙 타민 시약 (Invitrogen)으로 형질 감염을 수행 하였다. 특정 렌티 바이러스 shRNA (AKT1의 경우 TRCN0000022937 또는 AKT2의 경우 TRCN0000055260, 시그마)를 사용하여 AKT1 또는 AKT2의 안정적인 결실을 수행 하였다. Shc-002 비 표적 shRNA를 대조군 벡터로 사용 하였다. 렌티 바이러스 제조를 위해, 특정 shRNA를 pCMV-dR 8.74 패키징 플라스미드 및 pMD2.G 플라스미드로 HEK239T 세포 내로 공동 형질 감염시켰다. 이틀 후 렌티 바이러스 입자를 수집하고 폴리 브렌 (Sigma)의 존재하에 세포를 형질 도입 하였다. Cells stably transfected were selected with 400 μg/ml Geneticin (G418, Invitrogen) or 5 μg/ml Puromicin (Calbiochem) according to selection gene in each case.

증식 분석

4 × 10 4 cells were seeded and maintained during 4 days in DMEM F12 5% SFB medium (for IBH-6) or 5 days in DMEM F12 2% charcoal stripped FBS (chFBS) + 20 nM insulin (for T47D). 매체는 격일로 변경되었습니다. At the end of the incubation cells were tripsinized and counted in Neubauer chamber.

상처 치유 분석

5 × 10 5 cells were seeded 24 hours prior to the experiment. Wound was made with a tip and incubated for 21 hours in DMEM F12 5% FBS medium. Photographs were taken all along the wound at the beginning (T0) and at the end of the experiment (Tf). Wound healing areas were quantified as T0-Tf using the ImageJ software.

Transwell assay

5 × 10 4 cells were seeded on top of 8 μm transwell inserts (BD Biosciences) previously coated with 1:6 Matrigel: DMEM F12 medium and incubated for 26 hours. Cells were fixed with cold methanol, stained with Cristal Violet 0, 1% and the cells that passed through the insert were quantified.

Western blots (WB)

Total protein extracts were obtained using RIPA buffer (Sigma). 100 μg of protein from each sample was separated in 10% polyacrylamide electrophoresis gels. Phosphorylated protein's bands were normalized using total proteins, with the density of bands from the control group set arbitrarily to 1.0 using the ImageJ software.

Immunofluorescence (IF)

Cells were fixed with PFA 4%, blocked with PBS 10% FBS and incubated with primary antibodies overnight. After washing with PBS, cells were incubated with FITC or Dylight secondary antibodies (Vector Laboratories Burlingame, CA) and nuclei were counterstained with propidium iodide (PI) or 4′, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Stained cells were analyzed under a Nikon Eclipse E800 Laser Confocal Microscope.

PathScan Intracellular Signaling Array Kit

PathScan Intracellular Signaling Array Kit (Chemiluminescent Readout) #7323 (Cell Signaling Technology) was performed following manufacturer´s instructions for IBH-6 and T47D cell lines modified to overexpress or dowregulate AKT isoforms.

In vivo studies

동물

NOD/LtSz-scid/IL-2Rgamma null mice (NSG) from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) were bred at IByME Animal Facility and two-month-old virgin females were used for the experiments. Animal care and manipulation were performed in agreement with the International Guidelines and Regulations from the National Institute of Health. IByME's Ethical Committee approved the experiments and the use of animals for this work CE 023-June 2014.

Xenografts and immunohistochemistry (IHQ)

For IBH-6 xenografts, mice were injected subcutaneously with 5 × 10 6 cells. For T47D xenografts, mice were implanted subcutaneously with silastic pellets containing 17β-estradiol (0.25 mg) and injected subcutaneously with 8 × 10 6 cells mixed with Matrigel. When tumors were palpable, sizes were measured with caliper Vernier and growth curves were performed plotting tumor size (mm 2 ) vs. time.

Tumors, lungs, liver, uterus and ovaries were fixed in 10% formalin, paraffin embedded (FFPE) and sectioned into 5 μm for histochemical analysis. Tumor and tissue histology were evaluated in hematoxylin/eosin (H&E)-stained slides. For IHQ, FFPE tissues were stained for primary antibodies. Primary antiserum was detected after incubation with a biotinylated secondary antibody (Vector Laboratories Inc.) using the Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories Inc.) and the diaminobenzidine (DAB) Chromogen and Substrate Buffer (Dako, Agilent Technologies). After IHC, the specimens were counterstained with hematoxylin, dehydrated, and mounted.

TCGA analysis

Open data from 1105 breast invasive carcinoma samples from The Cancer Genome Atlas dataset (TCGA) 40, 41 and cbioportal platform (//www.cbioportal.org) were used to link AKT alterations to clinical outcomes. For the survival analysis we considered mRNA expression data profiles by RNA Seq for AKT1 and AKT2 and an arbitrary overexpression level greater than three standard deviations from the mean in the reference population.

항체

Total AKT1/2/3 (8312), phosphorylated Ser473AKT1/2/3 (7985), ERK1/2 (94), β1-integrin (8978), cyclin D1 (753) and actin (1616) were purchased from Santa Cruz Biotechnology; total AKT1 (2938), total AKT2 (3063), phosphorylated Ser240/244S6 (2215) and E-cadherin (3195) from Cell Signaling Technology, phosphorylated Tyr861FAK (4804) from Abcam, vimentin (V6630) from Sigma, alpha-tubulin (MS-719) from Neomarkers and cytokeratin Clones AE1/AE3 (M3515) from Dako.

통계 분석

Statistical analyses were performed with the GraphPad Prism™ software 6.0 (GraphPad, Inc. CA). One way ANOVA followed by Tukey or Dunnet´s post-tests was used to compare means of multiple experimental groups. When comparing the means of two different groups, two-sided Student's t -test was applied. Tumor growth curves were studied using regression analysis, and the slopes compared using analysis of variance. In all graphs, the mean ± SEM are shown.

추가 정보

How to cite this article : Riggio, M. et al . AKT1 and AKT2 isoforms play distinct roles during breast cancer progression through the regulation of specific downstream proteins. 공상 과학 Rep. 7, 44244; doi: 10.1038/srep44244 (2017).

출판사 참고 사항 : Springer Nature는 출판 된지도 및 기관 소속의 관할권 주장과 관련하여 중립을 유지합니다.

추가 정보

PDF 파일

  1. 1.

    보충 자료

코멘트

의견을 제출하면 이용 약관 및 커뮤니티 지침을 준수하는 데 동의하는 것입니다. 욕설이 있거나 Google의 약관 또는 가이드 라인을 준수하지 않는 내용이 있으면 부적절한 것으로 표시하십시오.